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Dans la chromatographie sur couche mince (CCM) la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre, de matière plastique ou d'aluminium. Elle repose principalement sur des phénomènes d'adsorption. Apres que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent a une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.

Pour réaliser une CCM, il faut :

  • la cuve chromatographique : un récipient fermé par un couvercle étanche
  • la plaque CCM : une plaque couverte d’une couche d'environ 0,25 mm d’adsobant fixée sur à l'aide d'un liant
  • l'échantillon : environ 1µl de solution diluée ( 2 a 5 %) du mélange a analyser, déposé en un point repéré situe au-dessus de la surface de l'éluant
  • l'éluant : un solvant pur ou un mélange qui va migrer essentiellement par capillarité le long de la plaque en entrainant les composants de l'échantillon

Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant monte a travers la phase stationnaire. Chaque composant de l'échantillon est entrainé à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile.

Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.

Lorsque les conditions opératoires sont connues, la CCM permet un contrôle aise et rapide de la pureté d'un compose organique. Si l'analyse ne révèle la présence que d'une seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est pur. De plus, étant donne que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d'un mélange, on peut l'employer pour suivre la progression d'une réaction.

La chromatographie sur couche mince est également la technique habituellement employée pour rechercher le meilleur solvant, avant d'entreprendre une séparation par chromatographie sur colonne.

Pour réaliser une CCM, l'échantillon est mis en solution (2 a 5 %) dans un solvant volatil, qui n'est pas forcement le même que l’éluant, et déposée en un point de la plaque situe a environ 1 cm de la partie inferieure. Il est important que le diamètre de la tache de dépôt soit la plus petite possible. Ce sont généralement les dépôts les moins étalés qui permettent les meilleures séparations. Pour augmenter la quantité déposée, on effectue donc plusieurs dépôts au même point, en séchant rapidement entre chaque application. L'échantillon est déposé a l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire en appuyant légèrement et brièvement l'extrémité de la pipette sur la couche d'adsorbant tout en prenant soin de ne pas le détériorer.

On vérifie l'identité des composants présumes d'un échantillon, en procédant a un dépôt séparé d'une solution de chacun d'eux puis a celui de leur mélange.

On développe la plaque en faisant migrer le solvant. Habituellement, la plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant qui en recouvre le fond va monter. Le niveau de l’éluant est ajusté a environ 0,5 cm du fond de la cuve. Pendant le développement, la cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée. Lorsque la position du front du solvant arrive a environ 1 cm de l'extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant marqué par un trait fin, puis la plaque est séchée.

L'identification des substances isolées se fait selon différentes méthodes :

  • directement si les substances sont colorées
  • à l'aide de révélateurs qui les colorent
  • les substances ayant une absorption dans la région au-dessus de 230 nm sont étudiées sur des supports additionnés de corps fluorescents qui permet leur mise en évidence sous les UV.

Dans tous les cas, il faut noter les positions des taches en les dessinant car certains produits disparaissent avec le temps.

On calcule enfin le rapport frontal Rf qui est le rapport entre la distance parcourue par le composé dc mesuré au centre de la tache et la distance parcourue par le front du solvant ds.

Rf

Pour un couple éluant et support détermine, Rf est une caractéristique de chaque soluté a la température de l'expérience. Il est toujours indépendant de la taille de la plaque.

Choix de l'éluant

L'éluant est formé d'un solvant unique ou d'un mélange de solvants. Dans tous les cas, le choix de l’éluant est primordial. Un éluant qui entraîne tous les composants de l'échantillon est trop polaire; celui qui empêche leur migration ne l'est pas suffisamment.

Une méthode simple pour trouver l'éluant approprié au suivi d’un analyte particulier consiste à préparer des solutions de l'échantillon dans différents solvants. La concentration sera d'environ 2 à 5% en volume. A l'aide d'une micropipette, on dépose une goutte de chaque solution sur une plaque, chacune séparée d'environ 1 cm. Le meilleur éluant est celui qui, lorsqu'il a terminé sa migration, a entraîné le soluté à une distance d'environ la moitié de celle qu'il a parcourue.

Une autre méthode consiste à déposer une solution des substances à analyser en plusieurs points, séparés d'environ 2 cm. Après séchage, on applique au centre de chaque point une micropipette remplie des différents éluant. Après diffusion, l'éluant qui convient sépare les solutés.

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samedi, juillet 22, 2017