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Alors que les autres méthodes chromatographiques sont habituellement employées pour l'analyse et la séparation de très faibles quantités de produits, la chromatographie sur colonne peut être une méthode préparative. Elle permet en effet la séparation des constituants d'un mélange et leur isolement, à partir d'échantillons dont la masse peut atteindre plusieurs grammes.

Elle présente cependant plusieurs inconvénients:

  • Elle nécessite souvent une mise au point nécessitant de nombreux essais préparatoire.
  • Elle n’est adaptée qu’à la purification de faibles quantités de produit
  • de grandes quantités de solvant sont nécessaires à l'élution
  • la durée de l'élution est généralement très grande
  • La détection des composés exige une attention constante.

C'est une technique basée sur des phénomènes d'adsorption. On remplit une colonne de longueur et de section variable avec, le plus souvent, de l'alumine ou de la silice.

L'échantillon, en solution concentrée, est déposé en haut de la colonne. La séparation des composants résulte de l'écoulement continu d'un éluant, traversant la colonne par gravité ou sous l'effet d'une faible pression. Dans ce dernier cas, on parlera de chromatographie flash qui peut, d’ailleurs, être automatisée.

On utilise comme éluant un solvant unique ou bien un mélange dont on accroît progressivement la polarité de façon à accélérer le déplacement des composés.

Les molécules sont entraînées vers le bas à des vitesses variables selon leur affinité pour l'adsorbant et leur solubilité dans l'éluant. Le chromatogramme se développe en formant une succession de zones cylindriques qui se séparent en migrant. A mesure que chaque zone s'écoule de la colonne, on la recueille dans de petits flacons.

Quatre facteurs influence l’efficacité de la méthode :

  • l'adsorbant
  • l'éluant
  • la dimension de la colonne
  • la vitesse d'élution

L’adsorbant le plus utilisé est l'alumine. Cependant, on la limitera aux composés organiques stables car, étant basique, elle peut provoquer, par exemple la saponification des esters. Le gel de silice est également fréquemment utilisé pour la séparation de composés qui n'ont pas une stabilité suffisante pour être traités par l'alumine. Il est, lui, plutôt acide.

L'éluant est, en général, un mélange de deux solvants. Au début de l'élution, on commence par le solvant le moins polaire qui entraîne les substances les moins polaires, ensuite on augmente sa polarité en additionnant graduellement le solvant le plus polaire. Ainsi les composés les plus polaires, retenus sur l'adsorbant, ne migreront que graduellement vers le bas de la colonne. Il est important de comprendre qu’il est impossible de redescendre la polarité de l’éluant.

La vitesse d'élution doit être la plus constante possible. Il faut qu'elle soit suffisamment lente pour que le soluté soit au plus près de l'équilibre entre les phases liquide et adsorbée. Elle ne doit pas être trop lente car sinon les substances diffusent dans le solvant créant un élargissement des bandes et une séparation médiocre.

Le remplissage de la colonne est l'opération le plus délicate. Le remplissage doit être le plus homogène possible et exempt de bulle d'air. Les surfaces inférieure et supérieure de l'adsorbant doivent être parfaitement horizontales. Le remplissage peut être réalisé selon deux méthodes au choix :

  • Le remplissage par voie humide. On prépare dans un bécher un mélange homogénéisé de l'adsorbant et du moins polaire des solvants utilisé. On doit obtenir une bouillie suffisamment fluide pour couler facilement ; le gel de silice. On le fait ensuite couler dans la colonne. Tout en la tapotant pour favoriser le tassement de l'adsorbant. On ouvre le robinet de la colonne pour que le solvant s'écoule lentement et on poursuit l'addition de la bouillie. Pendant l'opération, on doit veiller à ce que le niveau de solvant soit toujours supérieur à celui de l'adsorbant qui ne doit jamais sécher.
  • Le remplissage par voie sèche. La colonne est remplie au deux tiers par le moins polaire des deux solvants et l'adsorbant en poudre est ajouté dans la colonne. Pendant l'addition, on tapote continuellement sur les parois pour obtenir un tassement maximal. Quand l’adsorbant forme une couche d'environ 2 cm, on ouvre le robinet pour faire couler lentement le solvant. On termine comme précédemment.

On laisse ensuite couler l’éluant jusqu’a se qu’il atteigne le haut de l’absorbant. L’échantillon a purifié est ensuite déposé sous sa forme la plus concentrée possible. On peut d’ailleurs réaliser un dépôt solide, c'est-à-dire près adsorber l’échantillon sur de l’adsorbant que l’on sèche avant de le déposer.

On réalise enfin l’élution en veillant à ce que la colonne ne sèche jamais. Pour la plupart des opérations, une vitesse de 5 à 50 gouttes à la minute convient.

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mercredi, août 16, 2017