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La chromatographie liquide haute performance ou haute pression est une technique de séparation analytique identique à la chromatographie liquide du point de vu des principes qui la sous-tendent. Elle est fréquemment utilisée en chimie analytique et en biochimie. Elle peut, de plus, etre utilisé en méthode semi-préparative, c'est-à-dire pour séparer quelques centaines de milligramme au sortir d’une synthèse.

La seule véritable différence avec la chromatographie liquide est que le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le système. Ce débit « haute pression » est permis par une pompe, généralement à deux pistons alternatifs.

Ce débit élevé diminue le temps nécessaire à l’analyse. De plus, la fine granulométrie de la phase stationnaire qui en augmente la surface d'échange permet une meilleure séparation des composants. Enfin, en HPLC, les pics obtenus sont plus étroits qu’en LC donc la résolution est améliorée.

La combinaison de ces attributs – rapidité efficacité et résolution élevées - conduit à l'appellation « haute performance ».

HPLC

L’injection du produit à séparer se fait dans un injecteur qui peut être :

  • Une boucle d'injection
  • Injecteur seringue
  • Extraction sur phase solide en ligne

Comme en LC, on fait souvent varier le solvant d’élution durant la séparation. On parle alors de mode « gradient » ou « élution graduée » par opposition au mode « isocratique », pour lequel la composition de la phase mobile reste constante.

Enfin, l’élément essentiel de la technique reste la colonne de séparation. Il en existe de très nombreuses sortes qui vont de la « colonne à tout faire » à la colonne extrêmement spécifique. Tous type de chromatographie peut être utilisé :

  • Chromatographie d'adsorption
  • Chromatographie de partage
  • Chromatographie par échange d'ions
  • Chromatographie d'exclusion stérique
  • Chromatographie chirale

En ce qui concerne les supports d’adsorption, on parle de phase normale lorsque l’adsorbant est polaire et acide ; généralement de la silice ; et de phase inverse lorsque l’adsorbant est apolaire ; généralement de la silice greffée d’alcane en C8 ou en C18 (C'est-à-dire composé de 8 ou 18 carbones). Dans ce dernier cas, le greffage est souvent sensible au pH. Un pH extrême conduira souvent à une destruction irrémédiable de l’adsorbant.

Enfin, il existe de nombreux type de détecteurs :

  • Détecteur UV à barrette de diodes (DAD), probablement le plus courant
  • Détecteur à absorption UV ou visible
  • Détecteur à indice de réfraction
  • Détecteur à fluorescence
  • Détecteur de type spectromètre de masse (MS)
  • Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL)
  • Détecteur électro-chimique (DEC)

Enfin, en sus de ces détecteurs, une chaine HPLC peut, de plus, être couplée à un système d’analyse comme un spectromètre de masse.

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samedi, juin 24, 2017